Ранее мы рассказали для чего проводится выделение ДНК растений и полимеразная цепная реакция. Следующий этап генетических анализов – электрофорез ДНК в агарозном геле. В 2023 году сотрудниками филиала ФБУ «Рослесозащита» «ЦЗЛ Республики Бурятия» было проведено 1896 анализов электрофореза на образцах с насаждений Байкальской природной территории.
Во время проведения электрофореза молекулы/фрагменты ДНК, заряженные отрицательно, под действием силы электрического поля движутся от отрицательного электрода - катода (" –") к положительному электроду - аноду ("+"). Агарозный гель, являясь вязкой средой, препятствует продвижению молекул/фрагментов - образцов ДНК, поэтому короткие фрагменты ДНК движутся к аноду быстрее, чем длинные. Отношение величины заряда нуклеиновых кислот, мало зависящей от рН окружающей среды, к их массе практически одинаково, поэтому метод электрофореза в агарозном геле позволяет оценить только размеры различных фрагментов ДНК.
В зависимости от цели эксперимента после проведения электрофореза в агарозном геле дальнейшее исследование может быть аналитическим и/или препаративным.
При аналитическом исследовании после электрофоретического разделения молекул ДНК, проводится последующая визуализация и анализ полученных результатов.
Препаративное исследование применяют для извлечения из геля разделенных компонентов используя несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию и др.
Электрофорез ДНК состоит из следующих этапов: 1. Подготовка к проведению анализа 2. Приготовление буферных растворов 3. Приготовление геля 4. Проведение электрофореза 5. Регистрация результатов
Результаты электрофореза ДНК в агарозном геле регистрируют в присутствии бромистого этидия. В лунки геля наносится проба ДНК, уже содержащий индикаторный краситель. Форму с гелем, содержащим нанесенные образцы переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания (напряжение 1-15 В/см длины геля), и проводят электрофоретическое разделение ДНК в направлении от катода к аноду. Чем ниже напряжение, тем выше разделяющая способность геля, полосы более четкие из-за меньшей диффузии, но электрофорез занимает больше времени. Контроль за электрофоретическим разделение осуществляется визуально по движению полосы красителя. По окончании электрофоретического разделения (когда индикаторный краситель достиг края геля) вынимают гель из формы и просматривают в ультрафиолетовом свете с помощью УФ-трансиллюминатора (желательно фотографируют).
